线粒体损伤目前被认为是急性肾损伤(AKI)以及AKI到慢性肾脏病(CKD)进展的重要介质。由于肾小管上皮细胞线粒体含量丰富，因此伴随线粒体的功能障碍导致的ROS释放、能量产生减少、线粒体膜通透性改变以外，线粒体DNA(mtDNA)还会泄露到胞质中，激活另一个关键信号通路即cGAS-STING信号通路，导致肾小管炎症和AKI的进展。cGAS-STING通路是先天免疫系统的一个组成部分，其功能是检测胞浆异常核酸的存在，并在反应中触发炎症基因的表达，从而导致防御机制的激活（见下图-思维导图）。因此今天要分享的这篇文献的highlights就是（见下图-GraphicalAbstract）：在AKI肾小管上皮细胞损伤后，环GMP-AMP合酶(cGAS)检测到泄露到胞质的mtDNA后即激活干扰素基因(STING)，STING是一种内质网(ER)驻留蛋白，它被激活后从ER转移到核周区，并与TANK结合激酶1(TBK1)形成复合物，后者被输送到内溶酶体，在其中TBK1磷酸化下游转录因子，包括核因子(NF-kB/P65)等。因此mtDNA-cGAS-STING信号通路诱导了包括促炎分子在内的下游因子的表达，参与募集中性粒细胞的浸润，是导致肾小管炎症的关键调节通路，并且目前成为预防肾小管炎症参与肾损害进展的潜在治疗靶点以及研究热点。接下来我们就详细地解读一下研究者们严谨的思路和文献精髓：首先，由于cGAS能够感受胞质中的异常核酸，包括微生物病原体核酸结构(如dsDNA\dsRNA\ssRNA)和来自自体细胞损伤后的核DNA以及mtDNA，因此此次研究中的动物AKI模型并没有采用脓毒症诱导的AKI，而是主要采用了顺铂诱导的AKI，以免脓毒症中cGAS能够感受到细菌、病毒特有的核酸结构而影响实验结果的可靠性。其次，由于临床中顺铂在肿瘤患者中使用十分普遍，且可以导致三分之一患者的近端肾小管肾毒性损伤，分子机制包括DNA损伤、线粒体功能障碍、氧化应激和炎症，但能够导致炎症和肾毒性的机制还不完全清楚。因此本篇文献就主要研究了顺铂诱导的AKI中线粒体损伤与肾小管炎症的关系。一、首先需要证实非感染性的动物AKI模型和人类AKI中是否有肾小管炎症并伴有cGAS-STING通路的激活？因此在给予小鼠腹腔注射顺铂后，显示出与炎症相关的严重肾小管损伤,并伴有血浆尿素氮升高(图1A和1B），提示顺铂诱导AKI的造模成功。受损小管中cGAS和STING表达水平显著增加(图1C），并且肾脏皮质中下游炎性细胞因子和其他炎症相关分子的表达增加(图1D)。另外，在人类AKI中也观察到cGAS-STING通路的激活：免疫组化和半定量测定显示，AKI患者肾脏标本中STING和下游的p65(NF-kB)表达增加，肾小管损伤评分与STING表达强度之间存在显著正相关(图S2)。这些数据说明非感染性的动物AKI模型和人类AKI中存在肾小管炎症并伴有cGAS-STING通路的激活。二、研究者们开始进一步证明敲除或抑制STING是否能够改善AKI小鼠的肾小管炎症？图1E表示STING-KO成功，且不影响上游cGAS表达。图1F、1G、1H表示sting-KO以后肾小管炎症、肾功能损伤程度均有改善。图1J、1K表示STING-KO以后中性粒细胞浸润程度减轻，说明敲除STING能够改善AKI小鼠的肾小管炎症，同时也能够改善肾小管间质中的中性粒细胞浸润程度。同样，STING的药物抑制剂C-对STING活性的抑制也改善了顺铂诱导的肾小管损伤、肾功能障碍和促炎分子的表达(图2A-2D)。三、继前两部分的invivo实验之后，研究者们在invitro上再次进行了分子水平的实验验证：cGAS-STING激活是否能够加剧顺铂诱导的近端小管细胞炎症？结果显示暴露于顺铂(20mM，48小时)的HK-2人近端肾小管细胞培养液中炎性细胞因子IL-6、IL-8以及其他相关炎症因子的mRNA和蛋白水平表达增加(图3A、3B)，cGAS和STING的mRNA和蛋白质水平表达也显著增加(图3C、3D），并且cGAMP的产生增加(图3E)，说明顺铂引起的肾小管炎症与cGAS-STING激活有关。并且，顺铂也增强了cGAS-STING通路下游分子TBK1和p65(NF-kB)的磷酸化蛋白水平的表达(图3F）。然而，cGAS-STING通路的另一个下游分子IRF3没有被磷酸化，也没有激活IFN-α和IFN-β的表达(图3G)。此外，重要的是研究结果显示了顺铂处理后的HK-2细胞中STING从内质网模式易位到了与高尔基体共定位的核周模式(图3H、3I、3J)。然后研究者们又进行了rescue实验：通过小干扰RNA(siRNA)敲低cGAS或STING后，显示顺铂诱导的HK-2细胞STING下游靶蛋白TBK1和p65(NF-kB)磷酸化下降(图4A)，从而减少了肾小管炎症因子的表达(图4B–4D)。另外，结果还显示了IFI16没有参与顺铂诱导的肾小管炎症(图S4)。说明肾小管炎症主要由cGAS-STING通路参与，而非IFI16-STING通路。以上结果说明cGAS-STING激活加剧了顺铂诱导的近端小管细胞损伤中的小管炎症。四、接着研究者们先需要证明顺铂是否可以导致肾小管上皮细胞中的线粒体损伤？实验结果显示顺铂确实以剂量依赖性方式损害线粒体功能：线粒体基础和最大呼吸功能均有下降，线粒体脂肪酸β-氧化随着ATP生成的减少而减少(图5A、5B）。线粒体膜通透性(根据去极化活细胞的数量估计)也随着促凋亡蛋白BAX(定位于线粒体外膜上、膜通透性转换孔的一个组成部分)的mRNA表达水平增加而增加(图5C、5D）。因此顺铂引起的cGAS-STING激活导致的肾小管炎症与线粒体损伤有关。五、实验到这里就只剩下需要证明是否是线粒体来源的DNA进入了胞质激活了cGAS-STING通路？HK-2细胞暴露于顺铂之后，胞质中的dsDNA信号显著增强(图6A、6B和6E），并且大部分dsDNA信号与线粒体共定位(图6C、6D）。基于这些发现，研究者们推测顺铂导致线粒体受损及mtDNA泄露。为了确认mtDNA释放到细胞质中，对HK-2细胞和小鼠肾皮质(图S5A)裂解物中无线粒体的细胞质部分进行了mtDNA特异性PCR(图6F和S5B)，结果支持了顺铂处理后dsDNA释放到细胞质中的假设，它与体内和体外线粒体转录因子A(TFAM)表达的改变无关，表明顺铂导致的mtDNA泄漏不是通过TFAM缺陷的方式发生的(图S6）。为了确定胞质中的mtDNA是否是cGAS-STING通路的配体，通过溴化乙锭(EtBr)去除HK-2细胞中的mtDNA(mtDNA拷贝数减少了约90%,图6G)；在这些mtDNA耗尽的HK-2细胞暴露于顺铂之后，TBK1和p65(NF-kB)磷酸化蛋白未再表达(图6H)，相应的下游炎症细胞因子表达显著减弱(图6I)。并且，在STINGsiRNA后用分离出来的mtDNA转染HK-2细胞(图S7)，结果显示STINGsiRNA后的mtDNA依旧能够诱导转染细胞的STING激活并诱导包括促炎分子在内的下游因子的表达；而通过rescue实验显示在mtDNA转染了STING敲降的HK-2细胞后则cGAS-STING信号减弱(图7A和7B）。并且通过对顺铂处理后的HK-2细胞质中的dsDNA、线粒体和BAX进行了三重荧光显微分析显示，细胞质mtDNA与BAX在线粒体附近共定位(图7C），进一步进行BAX敲低可以减弱顺铂导致的mtDNA泄漏以及下游促炎因子的表达相应减弱(图7D-7F），表明顺铂导致的mtDNA泄露是通过BAX在线粒体外膜上成孔释放到细胞质中。总之，这些数据表明顺铂诱导线粒体损伤后的mtDNA泄露到胞质中被cGAS感知并激活了STING进而导致了肾小管炎症，加重了AKI进展。本篇文献中所有数据综合表明：1、mtDNA以不包括TFAM缺陷的方式通过线粒体外膜中的BAX成孔释放到细胞质中，并涉及中性粒细胞在小管间质中浸润，导致肾功能恶化。（既往有研究表明TFAM是线粒体DNA复制和修复所必须的一种蛋白，TFAM缺陷可引起mtDNA进入细胞质中，但是在该研究中，用顺铂处理的HK-2细胞和顺铂诱导AKI小鼠受损的肾小管细胞中，BAX增加，而TFAM水平保持不变。）2、cGAS-STING通路的激活与cGAS和STING表达的增加以及下游介导的TBK1和p65的磷酸化有关。3、cGAS-STING通路激活后的下游目标蛋白表达与IRF3的磷酸化和1型IFN（图3G和S3C）的表达无关。4、STING的敲除改善了由顺铂引起的肾损伤和炎症反应，减少了中性粒细胞浸润的数量，这表明cGAS-STING通路的激活在由顺铂诱导的肾脏损伤方面有重大参与。然而，动物或细胞实验中STING-KO并没有完全消除损伤和炎症反应，研究者认为：(1)是由于该通路上游依然存在线粒体功能障碍的原因；(2)既往有研究表明TLR9也识别DNA，因此TLR9通路可能也参与了顺铂-AKI。整篇文献的内容讲完了，总结一下，该研究表明，线粒体损伤不仅导致能量生成减少，而且导致肾小管上皮细胞mtDNA泄漏到胞质中，成为激活cGAS-STING信号的关键机制，导致肾小管炎症和AKI进展。说明除了外源性DNA及自身细胞损伤后释放的DNA，mtDNA也可以作为cGAS的内源性配体，并有助于各种炎症相关疾病的进展。说到这里，除了AKI以外、我们肾病科医生还比较熟悉的造影剂肾病、狼疮性肾炎(这里又提到dsDNA是不是太熟悉了呢)等以及其他科疾病如肥胖、年龄相关的黄斑变性、神经退行性疾病、传染病和非酒精性脂肪肝炎等都与该通路激活有关。这些发现表明，mtDNA-cGAS-STING通路是与疾病伴随炎症的重要且常见的途径，可能是防止肾损伤进展的潜在治疗靶标！后记：科研成果的临床转化真的是一个水滴石穿、铁杵磨针的比较漫长的过程，但是无数个科研工作者和科学家们在微观上努力的一点点，也许就在宏观上前进了一小步，不积跬步无以至千里！我没有什么远大的科研抱负，只希望自己能作为无数滴水中的一滴也可以有所贡献，随着不断地学习，我也更加笃定培养逻辑思维能力在临床诊治患者中和科研实践中的重要性，希望自己能继续跟在这些优秀的人们后面一步一个脚印地踏实前行！“Trynottobe
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