通过测量在免疫细胞类型中稳定及特异性表达的标记基因的丰度，使用NanoString平台在LN、DN和NK肾活检组织中的基因水平上分析了免疫细胞群的分布。与NK相比，LN和DN肾脏均显示出总组织浸润白细胞、细胞毒性T细胞、TH1细胞、Treg细胞和巨噬细胞的显著增加，CD45细胞和T淋巴细胞也有所增加(图2)。
图1
图2
2.狼疮性肾炎肾脏中的CD8+T细胞显示出细胞毒性和增殖的增加
过度活跃的CD8+T细胞浸润在LN的肾脏损伤中起着关键作用，CD8+T细胞的活性可能是由于Ca2+信号的增加，而Ca2+信号又受Kv1.3通道的调节，Kv1.3可调节GrB的产生和T细胞的增殖。于是对LN、DN和NK的肾活检标本进行了Kv1.3、GrB和增殖标志物Ki-67的免疫荧光染色(图3A)。CD8+肾浸润性T细胞(KITs)中Kv1.3蛋白的表面丰度在LN和DN的肾组织中均比在NK中高(图3B)，且LN中CD8+T细胞的GrB(图3C)和Ki-67(图3D)也增加。这些结果表明，LNKITs中Kv1.3的高表达伴随着细胞毒性和细胞增殖的增加。因此，阻断狼疮性肾炎患者Tm细胞Kv1.3通道的治疗措施可降低KITs的活性。
图3
3.Kv1.3－NPs体外实验可降低LN患者Tm细胞中CD40L的表达和IFNγ产生
作者开发了抗Kv1.3的脂质纳米囊泡(Kv1.3-NPs)，并接有抗Tm淋巴细胞CD45RO标记的荧光单抗(图4A)。T细胞活化伴随着细胞质Ca2+的增加，Ca2+激活钙调神经磷酸酶，从而诱导NFAT核易位和CD40L及炎性细胞因子的下游转录，这两者都有助于狼疮性肾炎的发病。将从LN患者分离的CD3+T细胞与荧光Kv1.3-NPs一起孵育过夜。与scr-NP处理的对照组相比，用Kv1.3-NPs处理的细胞有效降低了体外LN患者循环Tm细胞的IFNγ和CD40L(图4B-K)。
图4
４.通过移植LN外周血单核细胞的人源化小鼠显示出狼疮性肾炎样表型
小鼠T细胞的离子通道组成与人类不同，鼠T细胞表达除Kv1.3以外的其他Kv通道，而在人类T细胞中Kv1.3是唯一存在的Kv通道。所以作者构建了人源化的SLE/LN小鼠模型。将LN患者的外周血单核细胞(PBMCs)植入严重免疫缺陷的NOD/LTSZ-SCIDIL-2RG/(NSG)小鼠，并在植入后6周分别评估免疫表型和肾脏病理学(图5A)。将移植有健康供体(HDs)的PBMC小鼠(HDs)和未移植的NSG小鼠(NE)用作对照。与HDs和NE小鼠相比，LN小鼠脾脏中CD8+、CD3+、CD4+和CD45+细胞的丰度均增加(图5B)，CD8/CD4比值有显著升高(图5C)且IgG抗体增加(图5D)。LN小鼠表现出SLE的特征:与对照组小鼠相比，IFNγ和CD3+CD8+T细胞肾浸润增加，存活率降低(图5F，G)。
与LN的PBMCs相似，来自LN小鼠的人CD3+T细胞在体外刺激时保持了产生大量IFNγ的能力，表明它们的病理特性在移植后保持了不变(图6)。随后进行了免疫荧光实验，以评估LN小鼠中的KITs与外周T细胞相比Kv1.3表型是否发生了改变。这些小鼠的CD8+KITs显示出比脾细胞更高的Kv1.3表达(图7)。LN小鼠KITs中Kv1.3的增加使该通道成为开发新免疫抑制疗法的潜在靶点。
图5
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5.Kv1.3-NPs降低CD40L和IFNγ，最终增加人源化LN小鼠的存活率
最后作者使用这种人源化LN小鼠模型，研究移植Kv1.3-NPs靶向治疗的供体PBMCs是否会改变LN的疾病进程。用Kv1.3-NPs预处理LN患者的PBMCs，将它们植入NSG小鼠，然后评估体内刺激后脾细胞、外周血t细胞以及骨髓和肺单细胞中CD40L和IFNγ的表达(图8A)，用scr-NPs处理的作为对照组。通过Kv1.3敲除成功地抑制了Tm细胞中CD40L的表达和IFNγ水平，并延长了LN小鼠的存活时间(图8B-E)。
图8
狼疮性肾炎(LN)是一种自身免疫性疾病，记忆性T(Tm)淋巴细胞会浸润肾脏，导致器官损伤。LN中会出现表达高电压依赖性Kv1.3钾通道活性的CD8+Tm细胞的高度浸润。在体外，选择性下调Tm细胞中Kv1.3钾通道的纳米粒子降低了LN患者Tm细胞中的CD40L和IFNγ。通过将来自LN患者的PBMC植入免疫缺陷小鼠，获得的人源化狼疮性肾炎小鼠。LN小鼠表现出LN的疾病的特征:与健康供体PBMC移植小鼠相比，IFNγ和CD3+CD8+T细胞肾浸润增加，存活率降低。移植前对患者PBMCs进行Kv1.3-NPs治疗可降低CD40L/IFNγ，延长狼疮性肾炎小鼠的生存期。总的而言，本文提供了针对SLE中Tm细胞浸润的有效靶点，靶向下调Kv1.3通道可改善KIT的Tm细胞浸润，为此Kv1.3通道是新的免疫抑制治疗的靶点。
撰写：孙文怡
编辑：张启祥
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